小骚货 丛林母土他乡迁播后的泥土真菌和细菌变化
泥土微生物对泥土的变成和发育、泥土肥力和物资轮回、种子萌生、植物生涯与孕育均有积极作用[1]，对保管泥土生态系统的观念具有迫切好奇瞻仰[2]。为了顺应生涯条目的变化，泥土微生物能改革代谢活性，明锐地响应泥土环境因子变化，常被视为泥土环境变化的教养因子[3]。真菌和细菌是泥土微生物中的迫切构成部分小骚货，与生态系统的健康密切揣度[4]。
中国南边岩溶区域的石漠化依然成为严重的生态问题。复原石漠化区的退化植被是石漠化惩办最迫切的任务之一[5]。迁播丛林泥土，激励里面的泥土种子库来从头构建植物群落已成为生态复原的一种新步地。澳大利亚的扩充标明，采矿区肤浅的表土复垦(新矿区表土迁播到旧矿区)后构建的新植物群落与原植物群落的不异性不高[6]。云南石林的计划则标明，迁播后的丛林母土萌生的幼苗群落与母土和受体均揣度，且受到环境因子的强烈影响[7]。估量以为幼苗萌生阶段泥土微生物的作用未得到有用施展[8]。泥土微生物是种子萌生和植物孕育不能或缺的条目[9]，Morpeth等对于泥土微生物对月季幼苗萌生的计划标明，未灭菌的泥土幼苗萌生率权贵高于灭菌的泥土幼苗萌生率[10]。梁作盼等[11]的计划标明，泥土微生物对紫茎泽兰的孕育有权贵的正反馈效应且权贵莳植其竞争上风。
本计划通过Illumina HiSeq高通量测序技巧比对迁播泥土、受体泥土和丛林母土微生物群落构成过火千般性，解析泥土迁播于受体后的微生物群落构成和千般性变化，为计划石漠化生态系统和泥土迁播技巧对石漠化生态系统复原的作用提供科学依据。
1 材料与措施 1.1 计划区域不祥计划地区位于云南省建水县东部面甸镇，地舆位置为N23°42′，E102°57′，海拔1 497±3 m。本区属典型的亚热带季风征象区，干湿季分明。年平均温度18.5 ℃，月平均最高温度27.5 ℃ (7月)，月平均最低温度11.6 ℃ (1月)，填塞最高气温42 ℃，填塞最低气温6 ℃，≥10 ℃的有用积温在2 895 ℃控制。年平均降雨量780.1 mm，无霜期305 d，85%以上的降雨集聚分散在雨季(5−9月)。年挥发量(2 600 mm控制)大于降雨量，具有干热河谷特征。
地带性次生林(丛林母土)和石漠化迹地(受体泥土)是建水县面甸镇地区主要的两大植被类型。地带性次生林植被群削发削发扬为：打扰相对较小，丛林植被未经过热烈遏止，偶见大树，物种丰富，生物千般性较强。物种以灌乔木为主，主要以铁橡栎(Quercus baronii)、黄连木(Pistacia chinensis)、假虎刺(Carissa spinarum)、小石积(Osteomeles anthyllidifolia)、短萼海桐(Pittosporum brevicalyx)、栎叶琵琶(Eriobotrya prinoides)、白枪杆(Fraxinus malacophylla)、肤盐木(Rhus chinensis)和滇合欢(Dalbergia kingiana)等为上风树种，秘籍面积占80%控制。
石漠化迹地发扬为地表和基岩表示，杂草丛生，太阳放射强，大气降水常通过地表径流、岩溶裂隙、落水洞、凹地等快速凯旋浸透地下岩溶空间，地表蓄水的智商差，最终导致该地区瘠薄、干燥、表示的生境面积不休扩大。植被以草本为主，主若是扭黄茅(Heteropogon contortus)、鬼针草(Bidens pilosa)、节节麦(Aegilops squarrosa)、地石榴(Ficus tikoua)和狼毒(Stellera chamaejasme)等，层盖度达90%以上。两样地相距约5 km，中间未发现其他次生林，地形和海拔不异，碳酸盐基岩开首议论。
1.2 泥土迁播及样品收集2017年5月于受体泥土随即偶然选拔10个5×5 m样方，为了防患原生草本过火泥土种子库对迁播泥土的影响，移除受体泥土随即上层10 cm泥土。于丛林样地内机械布设1×1 m样点，收集上层10 cm泥土，泥土收集比例为大地面积的2%，累计采土160 m2。将收集的母土实时运输到受体地，机械混匀，称重后平均迁播于各受体样方内，受体样地四周各留置0.5 m走谈用于施行数据不雅察和检测，各样方本体迁土面积为4×4 m，管护并监测植物幼苗萌生。2018年9月，在迁播样地一共记载到40个物种(灌木8种，乔木6种，藤本3种和草本23种)，其中许多上风光种来自母体丛林，比如铁橡栎(Quercus baronii)、白枪杆(Fraxinus malacophylla)、滇合欢(Dalbergia kingiana)、假虎刺(Carissa spinarum)、白刺花(Sophora davidii)、山莓(Rubus corchorifolius)、铜钱树(Paliurus hemsleyanus)和小石积(Osteomeles anthyllidifolia)。
2018年10月，辞别对迁播泥土、受体泥土及丛林母土进行泥土样品收集。母土丛林和受体样地辞别建设3个5×5 m的样方，各样方内按“Z”字形道路录取5个采样点，用100 cm3环刀取表土，夹杂后按四分法取不少于1 kg土样。对于迁播泥土采样，在每个5×5 m样方内建设3个取样点，用议论的措施进行采样。3个样地的样品等分为两份：一份带回实验室阴干过筛，用于泥土理化性质测定；一份干冰冷藏运输到生物公司检测泥土真菌和细菌千般性。
1.3 主要试剂和仪器PowerSoil® DNA Isolation Kit，MOBIO公司。电泳仪，北京市六一世物技巧有限公司；Illumina HiSeq 2500测序仪，Illumina公司；PCR仪，Applied Biosystems公司。
1.4 泥土营养测定把柄中华东谈主民共和国林业行业圭臬进行测定：电位法测定泥土悬液pH (LY/T 1239-1999)；重铬酸钾氧化-外加热法测定泥土有机质(soil organic matter，SOM) (LY/T 1237-1999)；碱解-扩散法测定泥土水解氮(hydrolysable nitrogen，Hy.N) (LY/T 1228-2015)；凯氏定氮法测定泥土全氮(total nitrogen，丝袜高跟T.N) (LY/T 1228-2015)；酸溶法测定泥土全磷(total phosphorus，T.P) (LY/T 1232-2015)；碳酸氢钠浸提法测定泥土有用磷(available phosphorus，A.P) (LY/T 1232-2015)；酸溶法测定泥土全钾(total potassium，T.K) (LY/T 1234-2015)；1 mol/L乙酸铵浸提测定泥土速效钾(available potassium，A.K) (LY/T 1234-2015)；1 mol/L乙酸铵浸提测定泥土全钙(total calcium，T.Ca) (LY/T 1234-2015)[12-13]。
1.5 泥土微生物测定 1.5.1 泥土DNA的索要遴选DNA索要试剂盒索要泥土总DNA。用1.8%琼脂糖凝胶电泳评价DNA质料，然后将DNA保存于−80 ℃，用作后续反应。
1.5.2 泥土微生物PCR扩增用通用引物对与衔尾子序列和条形码序列组合扩增细菌16S rRNA基因V3−V4区域(正向引物5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；反向引物5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和真菌ITS1区域(正向引物5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA A-3′；反向引物5′-GCTGCGTTCTTCATCGATG C-3′)。两个规画区域PCR反应体系：2×KOD FX Neo Buffer 25 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各1.5 μL，KOD FX Neo (1 U/μL) 1 μL，dNTPs (2 mmol/L) 10 μL，DNA 5 μL，ddH2O补足50 μL。PCR反应条目：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，15个轮回；72 ℃ 7 min。对规画区域PCR纯化后进行Solexa PCR，反应体系(40 μL)：主张区域PCR纯化居品10 μL，MPPI-a (10 μmol/L) 1 μL，MPPI-b (10 μmol/L) 1 μL，2×Phμsion HF MM 20 μL，ddH2O 8 μL。PCR反应条目：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10个轮回；72 ℃ 7 min。反应轨则后，用1.8%的琼脂糖凝胶磨砺。参照电泳初步定量效果，使用Qubit荧光定量系统对PCR居品进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，把柄精笃定量效果进行相应比例的夹杂。使用Illumina HiSeq 2500平台(2×250 paired ends)对纯化的归拢样品进行高通量测序分析。
1.6 数据分析使用QIIME (V1.8.0)软件中的UCLUST对Tags在97%的不异度水平下进行聚类，赢得OTU，并基于SILVA (细菌)和UNITE (真菌)分类学数据库对OTU进行分类学细心。欺诈QIIME软件生成不同分类水平上的物种品貌表，再欺诈R讲话器具绘图成样品各分类学水平下的群落结构图。使用Mothur (V1.30)软件，对样品α千般性指数进行评估。将样品所含序列数进行圭臬化后，使用QIIME软件进行β千般性(Beta diversity)分析。遴选Microsoft Excel 2010对泥土微生物、碳、氮、磷、钾、钙和有机质数据进行初步处理，转用SPSS软件进行统计分析。
2 效果与分析 2.1 丛林母土他乡迁播后的泥土理化性质变化丛林母土他乡迁播15个月后，迁播泥土pH值与丛林母体和受体泥土间无权贵互异，其值变动于(6.69±0.19)−(6.94±0.11)之间(表 1)。全碳、全氮、泥土有机质含量发扬为迁播泥土 > 丛林母体 > 受体泥土，但迁播泥土的全碳、全氮、泥土有机质含量与受体泥土有权贵互异(P < 0.05)，而与丛林母土间互异不权贵。全磷、有用磷、全钾含量发扬为丛林母土 > 迁播泥土 > 受体泥土，丛林母土与受体泥土间的全磷、有用磷、全钾含量互异权贵(P < 0.05)，两者和迁播泥土间互异不权贵。速效钾含量发扬为丛林母土 > 受体泥土 > 迁播泥土，迁播泥土的速效钾含量和丛林母土间互异权贵，两者和受体泥土间互异不权贵(P < 0.05)。水解氮和全钙含量三者间无权贵互异。
2.2 丛林母土、迁播泥土和受体泥土微生物群落Illumina HiSeq高通量测序并优化后共赢得675 401条真菌有用序列，总碱基数为2 277 bp，平均长度为253 bp，共产生1 289个OTU，其中迁播区1 071个OTU，受体1 102个OTU，母体663个OTU；细菌有用序列567 197条，总碱基数为3 777 bp，平均长度为419.7 bp，共产生1 591个OTU，其中迁播区1 587个OTU，受体1 575个OTU，母体1 543个OTU。
其实是香蕉在线视频观看样品稀释弧线涌现，随握续抽样的增多，真菌和细菌OTU出现的速度均趋于恣意(图 1)，文库的秘籍率(coverage)已杰出99% (表 2)，诠释在此环境下样品的OTU不会随测序数目的增多而权贵增多，本次测序深度不错反馈泥土真菌、细菌竟然切情况。
泥土真菌的上风门类为子囊菌门(Ascomycota，35.84%)和担子菌门(Basidiomycota，28.01%)。被孢霉门(Mortierellomycota，2.99%)等其余类群的平均相对品貌较低(相对品貌0.5%−5%) (图 2A)。泥土细菌上风门类为酸杆菌门(Acidobacteria，30.20%)、变形菌门(Proteobacteria，30.34%)、放线菌门(Actinobacteria，18.36%)、绿弯菌门(Chloroflexi，5.87%)，它们的平均相对品貌大于5%。相对品貌较低(相对品貌0.5%−5%)的类群有芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，4.82%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，2.79%)、疣微菌门(Verrucomicrobia，2.34%)、罗卡氏菌(Rokubacteria，2.04%)、浮霉菌门(Planctomycetes，0.51%) (图 2B)。
对门分类学水平下泥土中相对品貌大于5%的类群比拟分析标明：迁播泥土的子囊菌门(Ascomycota)相对品貌极权贵地高于丛林母体(P < 0.01)，迁播泥土担子菌门(Basidiomycota)相对品貌极权贵地低于丛林母体(P < 0.01)；迁播泥土酸杆菌门(Acidobacteria)相对品貌权贵高于丛林母土(P < 0.05)，迁播泥土变形菌门(Proteobacteria)相对品貌权贵高于受体泥土(P < 0.05)，迁播泥土放线菌门(Actinobacteria)相对品貌极权贵地低于受体泥土(P < 0.01)，迁播泥土绿弯菌门(Chloroflexi)相对品貌极权贵地低于丛林母土(P < 0.01)。
2.3 迁播泥土微生物与丛林母土和受体泥土的互异对3类样地泥土真菌和细菌群落进行主因素分析(principal component analysis，PCA)发现，泥土真菌(图 3A)第一主因素(PC1)和第二主因素(PC2)孝顺率辞别为65.16%和18.13%，累计孝顺率杰出80%，3类样地组间存在权贵互异(R=1.00，P=0.003)，3类样地样点间有权贵分离，诠释组间互异大于组内互异；泥土细菌(图 3B)第一主因素(PC1)和第二主因素(PC2)孝顺率辞别为49.45%和34.83%，累计孝顺率杰出80%，3类样地组间存在权贵互异(R=0.753，P=0.006)，3类样地样点间有权贵分离，诠释组间互异大于组内互异。
UPGMA聚类树涌现，迁播泥土真菌(图 4A)和细菌(图 4B)聚类距离与受体泥土更近，真菌和细菌物种构成均与受体泥土更不异，与丛林母土互异更大。品貌名次前十的上风属柱状图涌现，真菌和细菌品貌名次前十的上风属与受体泥土无权贵互异(P > 0.05)。
2.4 丛林表土他乡迁播后的泥土微生物千般性变化真菌和细菌丰富度用ACE和Chao1指数默示，千般性进度用Simpson指数和Shannon指数默示。迁播泥土真菌丰富度和千般性指数与丛林母土互异极权贵(P < 0.01)，与受体泥土无权贵互异(P > 0.05)；迁播泥土细菌丰富度和千般性指数与丛林母土互异权贵(P < 0.05)，ACE和Shannon与受体泥土无权贵互异(P > 0.05) (表 2)。
3 商榷与论断泥土微生物是陆地生态系统的迫切构成部分[14]。门分类学水平下绝大多数泥土中的上风真菌有子囊菌门、担子菌门、接种菌门、壶菌门和球囊菌门[15-17]；细菌有变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、浮霉菌门、厚壁菌门、疣微菌门和芽胞菌门[18-22]。本计划中检测到子囊菌门和担子菌门、酸杆菌门、变形菌门、放线菌门和绿弯菌门，与常见的泥土上风菌议论。可是，泥土迁播后，微生物群落的各门类的相对品貌发生变化，如子囊菌门和酸杆菌门相对品貌增多(权贵高于丛林母土)，担子菌门相对品貌裁汰(权贵低于丛林母土)，这可能与迁播后的泥土环境改革揣度。子囊菌门合适生活在通气性较好的泥土环境中[15]，在东谈主为搬运和再植经过中，土层变松软，通透性增强，为子囊菌门孕育提供了有益条目。酸杆菌门的孕育与泥土总氮成正揣度性[23]，而担子菌门孕育与泥土氮呈负揣度[24]，因此，担子菌门的相对品貌裁汰而酸杆菌门相对品貌增多。迁播泥土中变形菌门相对品貌仍权贵高于受体泥土，可能与迁播泥土中有较丰富的碳氮源揣度。Fierer假说以为，当泥土中碳氮源输入增多时，变形菌门等富营养型菌群品貌增多[25]。泥土pH值越高放线菌门和绿弯菌门品貌越低[26-27]，尽管泥土迁播后的pH值比受体略有增多(表 1)，但放线菌门和绿弯菌门相对品貌极权贵低于受体泥土，其机理尚待进一步计划。
植被复原会促进微生物群落的改革[28-29]。本计划中丛林母土区植被以乔木为主，受体泥土区植被以草本为主，而迁播区则是迁播泥土中所佩戴的种子库萌生和孕育15个月后的新植物群落。植物种子萌生、幼苗树立和新群落的构建经过中，泥土微环境发生变化，新群落构建与泥土真菌、细菌群落的变化经过相互促进、相互作用，促使泥土真菌和细菌群落构成与千般性发生改革。诚然，植物群落的构建经过和效果及微生物的变化经过和效果也会影响泥土的理化性质[30]。泥土微生物对所依存的微环境极其明锐，会对环境要挟作念出响应[31]。丛林泥土迁播到石漠化迹地(受体)后，离开了蓝本的林冠保护，置于石漠化迹地的强光和轩敞生境下，其光、温、水等环境因子发生剧烈变化，无数的枯落物观念，开释出碳和有机质，增高了泥土的氮(表 1)。由此引发了真菌和细菌群落的构成和生物千般性的变化。生境泥土营养构成和含量高下影响泥土微生物[32-33]，有机质升高会导致真菌和细菌千般性升高[23]。本计划中迁播泥土有机质含量升高(表 1)，使真菌和细菌丰富度和千般性指数增高。主因素分析标明，3类样地泥土真菌和细菌群落构成存在权贵互异。UPGMA聚类树(图 4)和名次前十的上风属柱状图(图 4)涌现，石漠化样地经过为期15个月的丛林表土迁播后，迁播泥土真菌和细菌群落物种构成与受体更不异，与受体泥土聚类距离更近，而与丛林母土的距离更远。迁播泥土的真菌和细菌丰富度指数和千般性指数与受体泥土无权贵互异(P > 0.05)。标明泥土迁播之后受到石漠化迹地生态要挟和植被的影响，为顺应新的生境，其微生物群落的构成和结构向受体泥土微生物变化。
泥土微生物对泥土品性[34]、植物种子的萌生和幼苗树立具有迫切作用[9]。石漠化生态复原和惩办是一项终点吃力的工程小骚货，泥土微生物群落在植物群落构建中施展着迫切作用。本计划仅录取了一个时候段(迁播15个月后)，无法评估丛林表土迁播后的微生物群落变化经过，难以对植物群落构建的影响进行全面评估，可是不错为在生态复原和惩办经过中应用的泥土迁播技巧提供一定的科学价值和表面依据。